中华肿瘤杂志

作者：何若凡,王琴,林春霖,林鹏航,陈辉,黄永建,杨树钢,叶建新,朱广伟

关键词：结直肠肿瘤;肿瘤坏死因子受体相关因子6;泛素化;突变;核因子κB;激活蛋白1

基金：国家自然科学基金\u003C\u002Ffunding-source\u003E\u003Caward-id\u003E81702424、81872364

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)第331位泛素化位点突变对结直肠癌细胞生物学特征的影响及其相关机制。方法 将带有绿色荧光蛋白标签的TRAF6基因表达质粒的慢病毒(pCDH－3×FLAG－TRAF6)和突变质粒慢病毒(pCDH－3×FLAG －TRAF6－331mut)分别感染结直肠癌细胞SW480和HCT116，荧光显微镜观察细胞感染情况，Western blot检测TRAF6和TRAF6－331mut在细胞中的表达。采用细胞计数试剂盒8法和平板克隆实验检测TRAF6组和TRAF6－331mut组结直肠癌细胞的增殖能力，细胞划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力，免疫共沉淀方法检测TRAF6和TRAF6－331mut与泛素的赖氨酸结合位点K48和K63的泛素化作用，Western blot检测过表达TRAF6和TRAF6－331mut对核因子κB(NF－κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白1(AP－1)信号通路的影响。结果 荧光显微镜下观察到病毒成功感染结直肠癌细胞。Western blot检测显示，TRAF6和TRAF6－331mut在结直肠癌细胞中成功表达。CCK－8法检测结果显示，到第4天，TRAF6－331mut组HCT116和SW480细胞的值分别为1.89±0.39和1.88±0.24，均低于TRAF6组(分别为2.09±0.12和2.17±0.45，值分别为0.036和0.011)。平板克隆形成实验结果显示，TRAF6－331mut组HCT116和SW480细胞的克隆数分别为(120±14)个和(85±14)个，均低于TRAF6组[分别为(190±21)个和(125±13)个，值分别为0.001和0.002]。细胞划痕实验结果显示，48 h后，TRAF6－331mut组HCT116和SW480细胞的伤口愈合距离百分比分别为(31±12)%和(33±14)%，均低于TRAF6组[分别为(43±13)%和(43±7)%，值分别为0.005和0.009]。Transwell迁移实验结果显示，TRAF6－331mut组HCT116和SW480细胞的迁移数分别为(104±13)个和(107±12)个，均低于TRAF6组[分别为(172±19)个和(138±16)个，值分别为<0.001和0.002]。Transwell侵袭实验结果显示，TRAF6－331mut组HCT116和SW480细胞的穿膜数分别为(103±17)个和(92±13)个，均低于TRAF6组[分别为(177±20)个和(127±18)个，值分别为0.008和0.009]。免疫共沉淀法检测结果显示，在与K48共转染的293T细胞中，被TRAF6－331mut下拉的K48链泛素蛋白的表达量为0.57±0.19，低于野生型TRAF6下拉的K48链泛素蛋白的表达量(0.84±0.04，＝0.014)；在与K63共转染的293T细胞中，被TRAF6－331mut下拉的K63链泛素蛋白的表达量为0.31±0.13，低于野生型TRAF6下拉的K63链泛素蛋白的表达量(0.89±0.08，<0.001)。Western blot检测显示，TRAF6－331mut－HCT116细胞中NF－κB、p－NF－κB和p－AP－1蛋白表达水平分别为0.63±0.08、0.42±0.08和0.60±0.07，低于TRAF6－HCT116细胞(均为1.00±0.00，值分别为0.002、<0.001和<0.001)，AP－1蛋白表达水平为0.89±0.06，与TRAF6－HCT116细胞(1.00±0.00)比较，差异无统计学意义(＝0.051)；TRAF6－331mut－SW480细胞中NF－κB、p－NF－κB和p－AP－1蛋白表达水平分别为0.50±0.06、0.51±0.04和0.48±0.02，低于TRAF6－SW480细胞(均为1.00±0.00，均<0.001)，AP－1蛋白表达水平为0.90±0.06，与TRAF6－ SW480细胞(1.00±0.00)比较，差异无统计学意义(＝0.087)。结论 TRAF6基因第331泛素化位点突变可能阻止了TRAF6与泛素赖氨酸位点K48和K63的结合，进而影响下游NF－κB和MAPKs/AP－1信号通路相关蛋白的表达，抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

来源：2023年第02期

《中华肿瘤》期刊编辑部

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