中华肿瘤杂志

作者：闵静婷,张露,龙赤荣,樊红莲,李正红

关键词：肺肿瘤;嵌合抗原受体;c－Met

基金：国家自然科学基金E81472656

目的 制备靶向c－Met蛋白的嵌合抗原受体T细胞(CAR－T)，并检测其对人非小细胞肺癌(NSCLC)H1975细胞的体外杀伤作用。方法 将含c－Met抗体scFv片段的CAR序列插入慢病毒质粒中，用酶切质粒电泳，检测目的基因正确性。质粒转染工具为HEK293细胞，收集浓缩慢病毒，通过慢病毒感染的方式制备第二代c－Met CAR－T，通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT－PCR)、Western blot验证CAR序列的表达，采用流式细胞术检测c－Met CAR－T的阳性率、细胞亚型，流式细胞术验证NSCLC细胞H1975中c－Met蛋白的阳性表达并选择c－Met蛋白阴性表达的卵巢癌细胞A2780作为对照，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测c－Met CAR－T在效靶比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶20时对H1975细胞的杀伤作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测c－Met CAR－T在靶抗原刺激下，细胞因子白细胞介素2(IL－2)、肿瘤坏死因子α(TNF－α)和IFN－γ的释放情况。结果 成功合成c－Met CAR慢病毒重组质粒，酶切条带位置符合理论值。基因测序结果符合原设计序列，并成功包装慢病毒。Western blot和qRT－PCR结果显示，CAR分子存在于慢病毒感染后的T细胞中，c－Met CAR－T构建成功。c－Met CAR－T阳性率可达38.4%以上，且在慢病毒感染过后CD8 T细胞比例有所上调。流式细胞术验证结果显示，NSCLC细胞H1975有较强的c－Met蛋白表达，卵巢癌细胞A2780 c－Met蛋白表达阴性。LDH释放实验提示，c－Met CAR－T的抗肿瘤作用随效靶比的提升而增强，且均高于对照组，当效靶比为20∶1时杀伤率达到51.12%。ELISA检测结果显示，与对照组比较，在靶细胞刺激下c－Met CAR－T能释放出更多的IL－2、TNF－α和IFN－γ，而Non target组无此效应。 结论 c－Met在NSCLC细胞系H1975中表达，可以作为NSCLC免疫治疗的靶点；靶向c－Met的CAR－T能对c－Met阳性肺癌细胞产生较强的体外杀伤作用。

来源：2023年第04期

《中华肿瘤》期刊编辑部

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